激光共聚焦顯微鏡是測量儀器中的一種，但是很多人對激光共聚焦顯微鏡卻并不了解。為增進(jìn)大家對激光共聚焦顯微鏡的認(rèn)識，本文將對激光共聚焦顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡的結(jié)構(gòu)予以介紹。如果你對激光共聚焦顯微鏡具有興趣，不妨繼續(xù)往下閱讀哦。

一、激光共聚焦顯微鏡

激光掃描共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，簡稱CLSM)是近代生物醫(yī)學(xué)圖像儀器。它是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針。

利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化。

激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope)是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來并得到廣泛應(yīng)用的新技術(shù)，它是激光、電子攝像和計(jì)算機(jī)圖像處理等現(xiàn)代高科技手段滲透，并與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡結(jié)合產(chǎn)生的先進(jìn)的細(xì)胞分子生物學(xué)分析儀器，在生物及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的必備工具。

傳統(tǒng)熒光顯微鏡使用熒光物質(zhì)標(biāo)志細(xì)胞中的特定結(jié)構(gòu)，不僅圖像與背景的對比度增強(qiáng)，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辨率(δ=0.61·λ/NA，其中δ為顯微鏡的分辨率;λ為照明光線的波長;NA 為物鏡的數(shù)值孔徑)。但當(dāng)所觀察的熒光標(biāo)本稍厚時(shí)，傳統(tǒng)熒光顯微鏡一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)就顯現(xiàn)出來：焦平面以外的熒光結(jié)構(gòu)模糊、發(fā)虛。原因是大多數(shù)生物學(xué)標(biāo)本是層次區(qū)別的重疊結(jié)構(gòu)(如耳蝸基底膜。其實(shí)是外毛細(xì)胞 、多種支持細(xì)胞 、神經(jīng)纖維等組成的空間結(jié)構(gòu)),，在普通光學(xué)顯微鏡下聚焦平面的變化， 會表現(xiàn)出不同的形態(tài)。假若熒光標(biāo)記的結(jié)構(gòu)在不同層次上都有分布，且重疊在一起，反射熒光顯微鏡(epifluorescent microscope)不僅從焦平面上收集光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡所接收，熒光顯微鏡的光學(xué)分辨率就要大大降低 。

在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上，激光掃描共聚焦顯微鏡用激光作為光源，采用共軛聚焦原理和裝置，并利用計(jì)算機(jī)對所觀察的對象進(jìn)行數(shù)字圖像處理觀察、分析和輸出。 其特點(diǎn)是可以對樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，進(jìn)行無損傷觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)。 同時(shí)，利用免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記探針，該技術(shù)不僅可觀察固定的細(xì)胞、組織切片,還可以對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子及生命活動進(jìn)行實(shí)時(shí)動態(tài)觀察和檢測，在亞細(xì)胞水平上觀察諸如 Ca2+，pH 值，膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具，極大地豐富了人們對細(xì)胞生命現(xiàn)象的認(rèn)識。

二、激光共聚焦顯微鏡結(jié)構(gòu)

激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)用激光作掃描光源，逐點(diǎn)、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個(gè)物鏡，物鏡的焦點(diǎn)即掃描激光的聚焦點(diǎn)，也是瞬時(shí)成像的物點(diǎn)。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個(gè)平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時(shí)，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計(jì)算機(jī)內(nèi)，通過計(jì)算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。

在結(jié)構(gòu)配置上，激光掃描共聚焦顯微鏡除了包括普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造外，還包括激光光源、掃描裝置、檢測器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng) (包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換、應(yīng)用軟件)、圖像輸出設(shè)備、光學(xué)裝置和共聚焦系統(tǒng)等部分。由于該儀器具有高分辨率、高靈敏度、“光學(xué)切片”(Optical sectioning)、三維重建、動態(tài)分析等優(yōu)點(diǎn)，因而為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的研究提供了有效手段。此外，CLSM 對熒光樣品的觀察具有明顯的優(yōu)勢，只要能用熒光探針進(jìn)行標(biāo)記的樣品就可用其觀察。

激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)，也可以用于細(xì)胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計(jì)以及細(xì)胞形態(tài)的測量, 配合焦點(diǎn)穩(wěn)定系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)長時(shí)間活細(xì)胞動態(tài)觀察。

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