"利用NI公司的Compact DAQ硬件系統(tǒng)，以及用于控制和數(shù)據(jù)分析的LabVIEW圖形化系統(tǒng)設(shè)計軟件，我們創(chuàng)建了一個小型且便攜式的系統(tǒng)。"Hsieh Tseng Ming James, Institute of Bioengineering and Nanotechnology, A-Star

The Challenge:開發(fā)一個比傳統(tǒng)系統(tǒng)更加易于使用的，易于攜帶的，并且成本更低廉的小型熱循環(huán)儀。

The Solution:

使用NI公司的CompactDAQ硬件系統(tǒng)和LabVIEW軟件來創(chuàng)建小型熱循環(huán)儀，并且憑借USB接口的即插即用功能，以執(zhí)行實時的聚合酶鏈反應(yīng)。

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)熱循環(huán)是進行分子診斷的黃金準則。然而，在應(yīng)對流感大流行方面，全球所面臨的主要挑戰(zhàn)是只有專業(yè)人員才能進行有效的診斷測試。此外，商業(yè)上可用的熱循環(huán)儀也只能用于實驗室環(huán)境使用，因此，我們很難對其進行操作，要將商用熱循環(huán)儀的應(yīng)用領(lǐng)域擴大到緊急情況下，以及公共檢測站，例如機場，其笨重且昂貴的特性無疑是一個障礙。

因此，迫切需要我們開發(fā)一種便宜的，可攜帶的，且可任意使用的分子診斷工具。為了提供靈活的，成本低廉的診斷系統(tǒng)，我們在新加坡生物工程和納米技術(shù)研究所的研究小組開發(fā)了一個小型診斷系統(tǒng)，該診斷系統(tǒng)采用美國疾病控制和預(yù)防中心(CDC)所推薦的PCR技術(shù)來檢測傳染性急病。

我們的系統(tǒng)從實時PCR到病毒基因目標鏈的檢測對整個診斷過程進行整合與自動化，以執(zhí)行數(shù)據(jù)的分析。通過使用NI 公司的CompactDAQ硬件系統(tǒng)，以及用于控制和數(shù)據(jù)分析的LabVIEW圖形化系統(tǒng)設(shè)計軟件作為我們的解決方案，我們創(chuàng)建了一個小型且便攜式的系統(tǒng)。該系統(tǒng)由一個較小的珀爾帖器(溫度裝置)，電源供應(yīng)器(能量裝置)，和具有USB接口即插即用功能的光檢測器(光學裝置)構(gòu)成。

我們的熱循環(huán)儀是便攜式的，完全自動化的，且可用于在重要場合中大規(guī)模健康檢查的情況下使用，例如在機場檢查站控制傳染性疾病的傳播。系統(tǒng)自動化是可靠診斷的一個關(guān)鍵優(yōu)勢，因為流感大流行可能會在偏遠地區(qū)發(fā)生，那里可能沒有受過專業(yè)訓練的人員處理試驗樣品。此外，系統(tǒng)自動化的實現(xiàn)大大降低了人力和培訓費用。

利用該系統(tǒng)同時運行包含預(yù)加載PCR反應(yīng)物的三個聚合物，從抽樣到結(jié)果所花費時間不到一小時，并且允許采用大量生物的多樣性。利用熱敏電阻的實時溫度反饋，一個內(nèi)部比例積分微分(PID)芯片來處理溫度控制。該控制器由一個補償器，輸出裝置和傳感器反饋信號組成，反饋信號對于控制加熱器輸出功率，以及保持溫度是很必要的。

使用LabVIEW軟件，我們對圖形用戶接口進行編程，以顯示實時溫度，設(shè)置溫度，并且顯示來自三個通道的實時PCR結(jié)果 (如圖1A所示)。

系統(tǒng)配置

整個集成系統(tǒng)的配置包括執(zhí)行PCR系統(tǒng)運行和反應(yīng)的循環(huán)溫控系統(tǒng)、固定安裝的三個藍色LED光源、排布于LED至光電倍增管(PMT)光路之間用于實時光學探測的相關(guān)透鏡和濾波器。系統(tǒng)中包括一組銅制或黃銅制的加熱室，與放置樣本的聚合體反應(yīng)室集成在一起。LabVIEW是系統(tǒng)構(gòu)架的核心，中心處理器單元的設(shè)計專門針對執(zhí)行由LabVIEW預(yù)編寫的指令，可用于控制系統(tǒng)啟動和健康檢查、PCR運行的熱量循環(huán)控制、和多路復用熒光信號的光學檢測。

在PCR處理的循環(huán)溫控過程中，系統(tǒng)于退火循環(huán)的最后一秒進行光學檢測。三個LED同時由來自NI 9265模擬輸出模塊的電流驅(qū)動依次點亮，每個LED持續(xù)發(fā)光200 ms，在下一個LED燈點亮前熄滅當前LED燈。特殊設(shè)計的裝置用于聚焦和引導LED光路傳輸。光在照射到放置DNA樣本的反應(yīng)室之前要先通過一個濾波器。光線在到達PMT之前還需通過一系列透鏡和濾波器，最后由NI 9206模擬輸入模塊讀出該信號。

我們使用LabVIEW來進行信號處理以獲取數(shù)據(jù)集的均值，來自PMT的信號被放大并處理。之后將向用戶顯示數(shù)據(jù)，并通過主用戶菜單將該數(shù)據(jù)連續(xù)更新于三個獨立的曲線圖中(見圖2)。PCR混合物被置于聚碳酸酯PCR反應(yīng)室中，并加油以防止蒸發(fā)。PCR在以下溫度條件下完成：95 °C下持續(xù)20秒(Taq聚合酶活化) 、50 次循環(huán)的放大(在95 °C下保持5秒進行加熱變性、在60 °C保持60秒進行退火和延伸)。LabVIEW程序記錄每次循環(huán)中DNA復制發(fā)出的熒光。

穩(wěn)定性和重用性

在分子診斷中，PCR是一種將特定DNA片段放大至分子級別的常用方法。在實現(xiàn)過程中，需要在94 °C下進行40至50次循環(huán)的熱變，在60 °C下進行退火，在60 °C下進行延伸。

整個過程的關(guān)鍵點在于精確的溫度控制，保持2 °C/s的溫度上升率，以避免產(chǎn)生或放大錯誤的DNA序列。我們使用LabVIEW來控制獨立的高端和低端參考輸出通道，并采用一塊由高速金屬氧化物半導體場效應(yīng)晶體管(MOSFET)組成的電路，設(shè)計并制造了片上加熱方案，實現(xiàn)了PWM實時控制。

溫度測量顯示，我們獲得的加溫和冷卻率分別為2.5 °C/s和2.2 °C/s。對于每一路的溫度設(shè)置，過沖小于1 °C，并且穩(wěn)定性保持在±0.1 °C。

結(jié)果與結(jié)論

我們使用1至104的TaqMan探針，通過連續(xù)稀釋的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)互補DNA(cDNA) 來確認PCR的實時探測性能。結(jié)果證實，從Ct曲線中確定的敏感度與市場上的實時熱循環(huán)儀(圖1B)性能相當。與市面上其它的熱循環(huán)儀相比，我們的系統(tǒng)更緊湊、便攜性更高，且恒溫性更好(表1)。系統(tǒng)的便攜性使其在大范圍流感爆發(fā)的早期發(fā)揮更大的作用。

同時，該診斷系統(tǒng)非常適合在門診、急診室、公共檢查站點等地使用。此外，由于其便攜性好、價格低、體積小、且使用方便等特點，該熱循環(huán)儀在食品安全方面具有潛在的優(yōu)勢。

參考文獻

1. J. Felbel, I. Bieber, J. M. Kohler, Chemical SuRFace Management for Micro PCR in Silicon Chip Thermocyclers, Proc. SPIE, 4937, 34-40, 2002.

2. S. Poser, T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J. M. Kohler, G. Mayer, A. Siebert, D. Schimkat, Temperature ControlLED Chip Reactor for Rapid PCR, 2002.